実験結果について
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実験結果について
ホタテ貝殻焼成水溶液 殺菌効果試験
１．目 的
合資会社協和が、「貝殻焼成カルシウム」を用いて作成した「ホタテ貝殻焼成水溶液」について、第三者の立場で殺菌効果に関する検証試験を行い、科学的な基礎データの蓄積を行う。
２．試験品名称
「ホタテ貝殻焼成水溶液」及び、その作成に使用した「貝殻焼成カルシウム」の商品名称は、以下の通り。その外観を図-１及び図-2 に示した。
貝殻焼成カルシウム：ちゅら除菌 （図-1）
ホタテ貝殻焼成水溶液：Earth Power Washer（アースパワーウォッシャー）（図-2）
図-1 ちゅら除菌
図-2 Earth Power Washer
３．試験機関
一般財団法人 沖縄県環境科学センター
４．試験期間
平成28 年4 月1 日～平成28 年4 月15 日
５．試験概要
１）供試菌株
a. 大腸菌：Escherichia coli
b. サルモネラ：Salmonella sp.
c. 腸炎ビブリオ：Vibrio parahaemolyticus
d. 黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus 腸
２）試験方法
ホタテ貝殻焼成水溶液に菌液を添加混合し、常温(約25℃)で1 分、5 分、15 分、30 分間作用させた液を、標準寒天培地に接種して培養を行った。培養後、形成された集落を計数し、1ml 当たりの菌数を算出した。
① 菌液の調整方法
・各菌株をブレインハートインヒュージョン（BHI）培地10ml で18～20時間増菌培養を行った。
・それぞれの菌液をMcFarland 1.0（菌数3.0×108 個/ml 程度）に調整した。
・大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラでは生理食塩水を用い、腸炎ビブリオは3％塩化ナトリウム水溶液を用いて、それぞれ106～108 個/ml レベルまで希釈を行い、試験に用いる菌液とした。
② 検証方法
ホタテ貝殻焼成水溶液10ml に対し、菌液を0.1ml 添加混合し、常温（約25℃）で、1 分、5 分、15 分、30 分間と時間を定め、菌液とホタテ貝殻焼成水溶液を接触させる。各時間経過後の試験液を標準寒天培地に接種し35±1℃で24 時間培養する。形成された集落について計数を行い接触時間の経時変化による菌数を確認した。
ホタテ貝殻焼成水溶液の代わりに、生理食塩水10ml に大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラの菌液0.1ml を添加混合、腸炎ビブリオについては3％塩化ナトリウム水溶液に菌液0.1ml を添加混合した液を作成し、標準寒天培地に接種・培養後計数を行い、ホタテ貝殻焼成水溶液を添加しない初期状態における1ml 当たりの菌数を算出した。
６．試験結果
試験結果を下表に示す。また、培養後のシャーレの状況を資料に添付する。
７．所 見
ホタテ貝殻焼成水溶液（Earth Power Washer）と菌液の接触時間経過による菌数を測定した結果、大腸菌、サルモネラ、腸炎ビブリオの3 菌種については1 分で菌を死滅させる結果が得られた。
黄色ブドウ球菌については、10 分を過ぎた頃から菌数の減少が見られ、30 分後に菌が死滅した。
a.大腸菌（E. coli ）
初期状態（上段左側）：生理食塩水に菌液を添加
添加試験（上段右側、下段）：ホタテ貝殻焼成水溶液に菌液を添加
b. サルモネラ
初期状態（上段左側）：生理食塩水に菌液を添加
添加試験（上段右側、下段）：ホタテ貝殻焼成水溶液に菌液を添加
c. 腸炎ビブリオ
初期状態（上段左側）：3％塩化ナトリウム水溶液に菌液を添加
添加試験（上段右側、下段）：ホタテ貝殻焼成水溶液に菌液を添加
b. 黄色ブドウ球菌（S. aureus ）
初期状態（上段左側）：生理食塩水に菌液を添加
添加試験（上段右側、下段）：ホタテ貝殻焼成水溶液に菌液を添加
ホタテ貝殻焼成水溶液 殺菌効果試験 No.2
１．目 的
合資会社協和が、「貝殻焼成カルシウム」を用いて作成した「ホタテ貝殻焼成水溶液」について、第三者の立場で殺菌効果に関する検証試験を行い、科学的な基礎データの蓄積を行う。
２．試験品名称
「ホタテ貝殻焼成水溶液」及び、その作成に使用した「貝殻焼成カルシウム」の商品名称は、以下の通り。その外観を図-１及び図-2 に示した。
貝殻焼成カルシウム：ちゅら除菌 （図-1）
ホタテ貝殻焼成水溶液：Earth Power Washer（アースパワーウォッシャー）（図-2）
図-1 ちゅら除菌
図-2 Earth Power Washer
３．試験機関
一般財団法人 沖縄県環境科学センター
４．試験期間
平成28 年7 月5 日～平成28 年9 月26 日
５．試験概要
１）供試菌株
a. 腸炎ビブリオ：Vibrio parahaemolyticus
b. 黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus
c. サルモネラ：Salmonella sp.
d. 大腸菌：Escherichia coli
２）試験方法
本試験No.2 では、ホタテ貝殻焼成水溶液殺菌効果試験No.1 で実施した実験データを基にして、希釈したホタテ貝殻焼成水溶液について4 菌種をそれぞれ添加混合し殺菌効果の検証を行った。ホタテ貝殻焼成水溶液の希釈水には、水道水を用いた。ホタテ貝殻焼成水溶液の希釈液及び菌液は、常温(約25℃)で各時間に作用させた後、標準寒天培地に接種して培養を行った。培養後、形成された集落を計数し、1ml 当たりの菌数を算出した。
1）菌液の調整方法
①a～d の各菌株をブレインハートインヒュージョン（BHI）培地10ml で18～20 時間増菌培養を行った。
②それぞれの菌液をMcFarland 1.0（菌数3.0×108 個/ml 程度）に調整した。
③大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラでは生理食塩水を用い、腸炎ビブリオは3％塩化ナトリウム水溶液を用いて、それぞれ105～106 個/ml レベルになるよう菌液を調整した。
2） 検証方法
（1）腸炎ビブリオ及び黄色ブドウ球菌の試験(常温：約25℃で実施)
①ホタテ貝殻焼成水溶液の5 倍及び10 倍希釈溶液を作成。
②各希釈液9ml に対し菌液を1ml 添加混合。
③作用時間について、腸炎ビブリオは、1 分及び5 分間、黄色ブドウ球菌は、10 分及び30 分間とした。
④時間経過毎に試験液を接種し標準寒天培地を用い混釈、35±1℃で24 時間培養した。
⑤発育した集落について計数を行い接触時間による経時変化を求めた。（表-1）
（2）対照試験
①対照試験として、黄色ブドウ球菌は、生理食塩水9ml に菌液1ml を添加、腸炎ビブリオは3％塩化ナトリウム水溶液9ml に菌液1ml を添加した。
②ホタテ貝殻焼成水溶液と同様に操作を行い、対照試料の1ml 当たりの菌数を算出した。（表-1）
（3） サルモネラ及び大腸菌
水道水を用いて、ホタテ貝殻焼成水溶液の2 倍、5 倍及び10 倍希釈溶液を作成した。各希釈溶液9ml に対し、サルモネラ及び大腸菌の調整液を1ml 添加し、作用時間を1 分及び5 分間と定め、（1）の試験と同様に操作を行い、1ml 当りの菌数を算出した。（表-2）
（4） 対照試験
対照試験として、生理食塩水9ml に菌液1ml を添加した液を作成し、ホタテ貝殻焼成水溶液と同様に操作を行い、対照試料の1ml 当たりの菌数を算出した。（表-2）
（5） 黄色ブドウ球菌
（1）の実験で効果が得らなかったことから、2 倍稀釈水溶液で検証を行った。これまでと同様の方法で調整を行い、接触時間を30、45、60 分に変更し実施した。対照試験も同様に行った。（表-3）
６．試験結果
試験結果を下表に示す。また、培養後のシャーレの状況を資料に添付する。
７．所 見
（1）腸炎ビブリオを用いた試験では、5 倍及び10 倍希釈液において1 分経過で死滅させる効果が得られた。
（2）サルモネラについては、2 倍希釈溶液では1 分経過で減少させることができた。
5 倍希釈溶液では、5 分経過で、9.6×102 個/ml、10 分経過で4.0×10 個/ml 残存した。10 倍希釈溶液では5 分経過で、4.3×103 個/ml、10 分経過で4.6×102 個/ml 残存した。
（3）大腸菌については、2 倍希釈溶液では1 分で死滅させる効果が得られた。5 倍希釈溶液では、1 分経過で3.0×102 個/ml、5 分経過で＜10 個/ml となった。10 倍希釈溶液では、1 分経過で1.5×104 個/ml、5 分経過で2.8×103 個/ml となった。
（4）黄色ブドウ球菌を用いた試験では、5 倍及び10 倍希釈液において30 分経過しても菌の減少は見られなかったことから、2 倍希釈溶液で検証した結果、30 分経過で1.2×103 個/ml、45 分経過で7.1×10 個/ml、60 分経過で＜10 個/ml となった。
a.腸炎ビブリオ
ブランク（左側上下段）：3％塩化ナトリウム水溶液水に菌液を添加
添加試験（中央、右側、上下段）：ホタテ貝殻焼成希釈水溶液に菌液を添加
b.黄色ブドウ球菌
ブランク（左側上下段）：生理食塩水に菌液を添加
添加試験（中央、右側、上下段）：ホタテ貝殻焼成希釈水溶液に菌液を添加
c.サルモネラ
ブランク（左側上下段）：生理食塩水に菌液を添加
添加試験（左から2～4 列、上下段）：ホタテ貝殻焼成希釈水溶液に菌液を添加
ｄ.大腸菌（E.coli）
ブランク（左側上下段）：生理食塩水に菌液を添加
添加試験（左から2～4 列、上下段）：ホタテ貝殻焼成希釈水溶液に菌液を添加
e.黄色ブドウ球菌
ブランク（上段）：生理食塩水に菌液を添加
添加試験（下段）：ホタテ貝殻焼成希釈水溶液に菌液を添加
